Как синтезировали вирус
Соня Пекова: РНК-вирусы мутируют, и их геном нестабилен. У них высокий уровень мутаций, и они не очень точны в репликации. Вирусная РНК обычно мутирует в областях, ответственных за выработку белка, используемых в качестве строительных блоков для «тела» вируса. Эта часть выполняет определенные функции вируса, такие как проникновение в клетку и взаимодействие с зараженной клеткой.
Однако, кроме того, есть еще регуляторная область генома вируса, какую можно рассматривать как командный центр, управляющий репликацией вируса. Эта часть генома SARS CoV-2 (COVID-19) выглядит необычно перемешанной, как если бы она была серьезно изменена. Мне трудно поверить, что такие интенсивные реструктуризация, вставка и удаление кода вирусной РНК произошли в природе, и после этого вирус смог бы выжить. Регуляторная часть вирусного генома обычно имеет низкую частоту мутаций. SARS CoV-2 (COVID-19) имеет нетипичную степень мутации, какая обычно осуществляется путем генетической модификации.
Когда я проводила исследования, клонирование вирусных мутаций было моей ежедневной работой, и мы привыкли клонировать различные генные вариации на культуральных средах. Например, мы видели, как безвредный ген превратился в ген, индуцирующий лимфому. Мутация может превратить что-то доброе в нечто очень вредное. У нас есть инструменты генной инженерии, способные на такие модификации.
Генетическая модификация может использоваться, например, для создания так называемых «дизайнерских младенцев», что было сделано китайским ученым, создавшим два генетически модифицированных эмбриона. Позже он был оштрафован и попал в тюрьму. Я могу представить, что есть и другие ученые, сделавшие то же самое, просто они никогда не признаются в этом. Все зависит от этики ученого, но я не уверена, является ли этика достаточной гарантией.
...
Эта статья вышла в очень авторитетном журнале Nature Medicine. Она, несомненно, очень хорошо и тщательно написана. Однако она целиком посвящена структурным генам этого вируса и ни словом не упоминает его регулирующую область. Индийские учёные, кстати, нашли структуры, похожие на структуры ВИЧ, как раз в структурной части вируса – насколько это соответствует действительности, я вам сказать не возьмусь. Но, как бы то ни было, статья в Nature Medicine вообще не рассматривает регулирующую область данного коронавируса, а мне кажется, что изменение в генокоде этого вируса находится как раз в этой регулирующей области.
Он ведёт себя очень необычно. В мире есть конечное количество вирусов, заражающих людей. Мы обычно можем по симптомам болезни приблизительно угадать, какой вирус её вызывает. Конечно, не на 100%, но мы можем сказать: если симптомы выглядят вот так, то это, скорее всего, какой-то из вирусов гриппа, когда понос – другой тип вируса, когда сыпь – мы ищем герпесвирусы. Поэтому, когда мы знаем, что болезнь вызывается коронавирусом, у неё будет определённое течение. Но у этого коронавируса совсем другая картина, это как будто новый тип болезни.
Когда клиническая картина вируса настолько отличается от других вирусов того же типа, это как минимум странно. Что касается его генокода – я многие годы посвятила молекулярной биологии и генетике, занималась клонированием и использовала разные части вирусов для генной инженерии – это очень распространённая практика. Когда я увидела эту последовательность (в регулирующей области), мне сразу показалось, что она не очень похожа на природную. Если бы мы говорили только о структурных генах, я бы не думала, что с этим вирусом что-то не так. Но нужно смотреть на весь геном, не исключая из рассмотрения другие его части, и, возможно, там мы найдём ответ...
Если, как я предполагаю, проблема лежит в регулирующей области, то победить вирус можно, вырубив эту регулирующую область. Если мы её выведем из строя, вирус погибнет. Так что, возможно, в конце концов нам придётся прибегнуть к генной терапии, каким-нибудь ДНК-вакцинам или чему-то подобному – молекулярному, а не иммунологическому.
Люк Монтанье: ...мы не были первыми. До нас этим же самым занималась группа индийских исследователей. Они опубликовали, точнее: попытались опубликовать результаты своей работы. Они провели анализ генома и показали, что в полном геноме этого вируса, этого коронавируса, имелась последовательность иного вируса, и – это сюрприз для меня – это была последовательность вируса иммунодефицита (СПИД).
Это было опубликовано индийцами. Однако их заставили дезавуировать свой анализ, отказаться от него, на них было оказано колоссальное давление, понимаете? Никто не хочет, чтобы истина увидела свет. Но истина в итоге все равно увидит свет, научная истина всегда пробивается к свету, даже если кому-то очень хочется ее скрыть...
Если вы хотите, чтобы в геноме коронавируса возникла бы последовательность вируса иммунодефицита, нужно обладать соответствующими инструментами на молекулярном уровне, это не может произойти естественно. Сам пациент, инфицированный СПИДом, этого сделать не может. В этом должен участвовать сотрудник лаборатории. Раньше для этого требовалась очень высокая квалификация, подобная манипуляция была по плечу очень немногим. Но уже несколько лет, как этот процесс очень упростился.
Гипотеза следующая. Вирус вышел за пределы этой лаборатории в Ухане, хотя это лаборатория очень высокой степени защиты. Но несмотря на все эти меры вирус, может быть, ускользнул из рук тех, кто его разрабатывал. История с рыбным рынком – это красивая сказка, но она не соответствует действительности, это слишком маловероятное развитие событий. Собственно говоря, у них был вирус летучей мыши, они над ним трудились, они его модифицировали...
Мне эта гипотеза (получить вакцину от СПИД) представляется наиболее правдоподобной. Они хотели произвести вакцину от заражения вирусом иммунодефицита человека, используя коронавирус. Коронавирус может быть ослаблен, чтобы не угрожать здоровью (жизни), и его в данном случае использовали в качестве вектора (носителя) для антигенов вируса, вызывающего СПИД. И таким образом это в итоге могло бы стать вакциной.
Вообще тайное станет явным в любом случае, рано или поздно. Повторяю, все выйдет наружу. Ведь там, в этом коронавирусе, была не только последовательность ВИЧ, там имелась и последовательность малярии.
Все это указывает, что некто – один человек или несколько – я не знаю, кто эти люди, и не мне называть их, в чем-то обвиняя, так вот, кто-то хотел создать вакцину против СПИДа, «вставив» секвенцию ВИЧ в коронавирус.
Жан-Клод Перез: Основным результатом этой обновленной версии статьи является формальное доказательство того, что коронавирус 2019-nCoV является частично синтетическим геномом. Мы доказываем концентрацию в небольшом районе уханьского нового генома (300 bp) 3 различных вставок гена ВИЧ1 ENVELOPPE и 3 других вставок ВИЧ2 и SIV (ENV и POL RT). Все это необычно и несет в себе отпечаток человеческой деятельности: логика, симметрии...
Наконец, мы задаем себе вопрос о возможном искусственном происхождении этого генома, в частности, из-за наличия фрагментов ретровирусов ВИЧ1, ВИЧ2 и SIV.
О возможном происхождении генома 2019-Ncov:
Весьма вероятно, что в этом регионе ЛИОН [4] уханьского генома произошло вмешательство человека:
Анализ этой области во всех коронавирусах показывает 100%-ный скачок в гомологии для уханьских геномов и только 70-80% для ближайших коронавирусов SARS. Также в геноме уже есть след ENV HIV1, который мы обозначаем здесь как SARS2003...
Несмотря на то, что в этом регионе нет следов ENV HIV1 (Lyons-weiler 20020) во всех других геномах коронавируса SARS, в самом деле, мы обнаруживаем в мини-области (243-86bp = ~ 160bp) 3 частичных региона ENV HIV1, которые все 3 «РАЗНЫЕ» и от 3 разных штаммов ВИЧ1:
COVID-19 (86-113) ==> в ENV HIV1: 1201 <==> 1228.
COVID-19 (213-244) ==> в ENV HIV1: 424 <==> 394.
COVID-19 (243-281) ==> в ENV HIV1: 1064 <==> 1029.
В ENV HIV1 здесь эти 3 области, будучи гипер-сжатыми в Лионе, wuhan (<200 б.п.), они более широко расположены в hiv1 env (394 <==> 1228), то есть> 830 б.п. Как объяснить эту концентрацию 3 последовательностей ENV HIV1???? Если не вмешательством человека?
Затем, вторично мы обнаружили 3 других региона от ВИЧ2 и SIV...
Свидетельство типа «разумной воли»...
Теперь см. графики 49 и затем 50.
Оба графика свидетельствуют о том, что 6 вставок ВИЧ / SIV не являются результатом естественной эволюции и мутаций.
В частности,
• Во-первых, 6 вставок очень смежны: 169 bp в пределах 275 bp
• Во-вторых, штаммы, инфицированные ВИЧ / SIV, очень однородны: Россия, Кот-д'Ивуар, Нидерланды, Малави.
• В-третьих, функции вставок также различны: 2 от POL / RT, 4 от функциональных генов ENVELOPPE.
В этой статье не сообщается, что мы также обнаружили в геноме COVID-19 3 других региона ВИЧ / SIV: один из ENVELOPPE, один из RT и один из INTEGRASE...
Два главных результата этой публикации ставят нас перед парадоксом:
С одной стороны, мы только что продемонстрировали, что этот геном covid-19 содержит вставку из 6 стратегических областей ВИЧ / SIV, сконцентрированных в мини-пространстве, составляющем менее 1% длины генома. Можно подумать, что такое «нарушение» могло повлиять только на глобальный порядок ДНК этого генома.
С другой стороны, мы также только что показали, что с момента появления первой атипичной пневмонии 2003 года глобальный порядок последовательных геномов только увеличивался, что подчеркивается здесь стационарными цифровыми волнами, калиброванными по возрастающим числам Фибоначчи. В частности, covid-19 структурирован на большом расстоянии волной амплитуды 21 bp. Тем не менее вырезка в этом геноме небольшого региона, включая 6 вставок ВИЧ / SIV, будет дополнительно усиливаться в организации, вызывая появление волн 34 bp (число Фибоначчи после 21 bp).
Мы должны сделать заключение относительно этого необычного факта:
Чтобы адаптироваться к нарушению своей ДНК, вызванному вставкой 6 кусочков ВИЧ / SIV, геном коронавируса, несомненно, повысил уровень своей глобальной организации за счет адаптационных мутаций.
И теперь нам придется опасаться, что этот геном будет продолжать мутировать, чтобы оптимизировать свой общий уровень организации...
Андрей Громов: Чем опасен COVID-19 – тем, что это уже совсем не вирусная эпидемия. То, что возникает васкулит, как раз говорит о том, что никакого сравнения с другими вирусами здесь не может быть. Это совсем другой процесс...
Это вирус нового типа. Его изменчивость делает его трудноуловимым. Он проявляет себя по-разному – мы начинаем лечить одну болезнь, а она переходит в другую. Обычно все вирусы мутируют в сторону ослабления, а у этого вдруг обнаруживаются новые агрессивные штаммы. Будет очень тяжелая волна эпидемии, если мы сейчас не научимся блокировать вирус терапевтически – блокировать не вакциной, а влиять на сам механизм развития заболевания. Ведь дальше коронавирус ныряет еще глубже – на уровень межклеточных разрушений, создавая фиброзы. Сейчас часть выздоровевших после тяжелых пневмоний становится инвалидами, но дальше будет еще хуже – следующие осложнения, которые вызовет вирус, это аутоиммунные заболевания, цирроз печени и рак.
Специалисты это уже понимают. COVID-19 действует на иммунитет: выключает интерфероны, выбивает Т-клетки – и хелперы, и киллеры, – а это основа защиты нашего организма. Коронавирус во многом похож на вирус СПИДа, недаром его одно время лечили препаратами, которые прописывают больным ВИЧ. Мало того, китайцы уже обнаружили, что белки вируса повреждают напрямую гемоглобин, выбивая оттуда ионы железа. Это приводит к гемолизу – разрушению эритроцитов. Тем временем освобожденные ионы железа вызывают мощную окислительную реакцию, настоящий пожар в организме. Сгорают сосуды, повреждается ДНК. И если сосуды еще можно восстановить, то изменения в ДНК на фоне сниженного иммунитета неизбежно приводят к аутоиммунным поражениям.
2. Что сделала Ши Чжэньли с коллегами?
Различие в использовании рецепторов между коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и SARS-подобным коронавирусом летучей мыши
Difference in Receptor Usage between Severe Acute Respiratory Syndrome (SARS) Coronavirus and SARS-Like Coronavirus of Bat Origin
Wuze Ren, Xiuxia Qu, Wendong Li, Zhenggang Han, Meng Yu, Peng Zhou, Shu-Yi Zhang, Lin-Fa Wang, Hongkui Deng, Zhengli Shi
Journal of Virology, February 2008
Краткое содержание
Тяжелый острый респираторный синдром (SARS) вызывается ассоциированным с SARS коронавирусом (SARS-CoV), который использует ангиотензинпревращающий фермент 2 (ACE2) в качестве своего рецептора для входа в клетку. Группа SARS-подобных CoVs (SL-CoV) была идентифицирована у подковоносых летучих мышей. SL-CoV и SARS-CoV имеют идентичные организации генома и высокую идентичность последовательностей, с основным исключением N-конца белка шипа (S), который, как известно, ответственен за связывание рецептора в CoV. В этой работе мы исследовали использование рецепторов SL-CoV S путем объединения псевдовирусной системы на основе вируса иммунодефицита человека с клеточными линиями, экспрессирующими молекулы ACE2 человека, циветы или подковоносой летучей мыши. В дополнение к полноразмерным S SL-CoV и SARS-CoV был сконструирован ряд S-химер путем вставки различных последовательностей SARS-CoV S в основную линию SL-CoV S. Несколько важных наблюдений были сделаны из этого исследования. Во-первых, SL-CoV S не смог использовать ни одну из трех молекул ACE2 в качестве своего рецептора. Во-вторых, SARS-CoV S не смог войти в клетки, экспрессирующие летучую мышь ACE2. В-третьих, химерный S, покрывающий ранее определенный рецептор-связывающий домен, приобрел способность проникать в клетки через человеческий ACE2, хотя и с разной эффективностью для разных конструкций. В-четвертых, было обнаружено, что минимальной области вставки (аминокислоты от 310 до 518) достаточно для преобразования SL-CoV S из не-ACE2-связывания в человеческое ACE2-связывание, что указывает на то, что SL-CoV S в значительной степени совместим с SARS-CoV S белок как по структуре, так и по функции. Обсуждается значение этих результатов в отношении происхождения вируса, рекомбинации вируса и переключения хозяина...
В этом исследовании для решения этих проблем была использована система на основе вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Наши результаты показали, что белок SL-CoV S не способен использовать белки ACE2 разных видов для входа в клетку, и что белок SARS-CoV S также не смог связать молекулу ACE2 подковоносой летучей мыши, Rhinolophus pearsonii. Однако, когда RBD SL-CoV S был заменен на RBD-CoV S, гибридный белок S смог использовать huACE2 для входа в клетку, подразумевая, что белки SL-CoV S структурно и функционально очень похожи на SARS-CoV S. Эти результаты показывают, что хотя обнаруженные у летучих мышей SL-CoV вряд ли могут заразить людей, использующих ACE2 в качестве рецептора, еще предстоит выяснить, способны ли они использовать другие поверхностные молекулы определенных типов клеток человека, чтобы получить вход. Также возможно, что эти вирусы могут стать заразными для человека, если они подвергаются изменению N-концевой последовательности, например, в результате рекомбинации с другими CoV, что, в свою очередь, может привести к продуктивному взаимодействию с ACE2 или другими поверхностными белками на клетках человека...
Полноразмерный S-ген летучей мыши SL-CoV (Rp3) клонировали путем амплификации ПЦР из кДНК, приготовленной с использованием образцов фекалий летучей мыши R. pearsonii, положительных на SL-CoV (29). После оптимизации кодонов для первых 400 bp на N-конце модифицированный ген S был клонирован в pcDNA3.1 (+). Для введения RBM SARS-CoV S в SL-CoV S кодирующую область от 424 до 494 BJ01-S использовали для замены соответствующих областей Rp3-S, в результате чего был получен химерный ген S (CS) обозначен CS424-494. Используя ту же стратегию, серию генов CS с последовательностями BJ01-S конструировали путем поэтапной замены. Чтобы облегчить конструирование S-химер, была введена точечная мутация (от A до G) в нуклеотиде 1825 (остаток A кодона ATG был обозначен как нуклеотид 1) для генерации уникального сайта EcoRI в S-открытой рамке считывания...
Конструирование и очистка псевдовирусов. Псевдовирусы на основе ВИЧ получали, как описано ранее (37). Вкратце, 12 мкг каждого из pHIV-Luc (pNL4.3.Luc.R-E-Luc) и S-экспрессирующих плазмид (или пустой векторный контроль) котрансфицировали в 2 × 106 клеток 293T в 10-см чашках. Через 8 ч среду заменяли свежей средой. Супернатанты собирали через 48 ч после трансфекции, очищали от клеточного дебриса центрифугированием при 3000 × g и фильтровали через фильтр с размером пор 0,45 мкм (Millipore). Псевдовирусы в супернатанте клеток (4 мл) очищали ультрацентрифугированием на 20% сахарозной подушке (4 мл) при 55000 × g в течение 60 минут с использованием ротора Ty90 (Beckman). Осажденные псевдовирусы растворяли в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (PBS) и хранили при -80°C в аликвотах до их использования. Для оценки включения белков S и ВИЧ р24 в псевдотипированные вирусы 20 мкл очищенных вирусов подвергали электрофорезу в додецилсульфат-полиакриламидном геле (SDS-PAGE) и Вестерн-блоттингу, как подробно описано ниже.
Анализ экспрессии белка S и упаковки псевдовируса вестерн-блоттингом. Лизаты клеток 293T и HeLa или гранулированных псевдовирионов разделяли с помощью SDS-PAGE (с использованием 8% гелей) с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану (Millipore). Для вестерн-блоттинга инкубацию с различными антителами проводили при комнатной температуре в течение 1 часа. Для определения экспрессии S мембрану инкубировали с MAb F26G8 (1: 1000) и связанные антитела определяли с использованием АР-конъюгированного козьего антимышиного IgG, также разведенного в 1: 1000. Чтобы обнаружить p24 ВИЧ в псевдовирусах, в качестве первого антитела в разведении 1: 1000 использовали MAb против ВИЧ p24 (p24 MAb), а затем то же самое АР-конъюгированное антитело, описанное выше...
Использование huACE2, pcACE2 и RpACE2 летучих мышей для проникновения в клетки различных псевдовирусов. Когда для заражения клеток HeLa, экспрессирующих huACE2, pcACE2 или RpACE2, использовали только псевдовирус ВИЧ / Rp3-S, только низкий уровень активности люциферазы (приблизительно 100 относительных световых единиц) , такой же, как уровень фона, генерируемый векторным контролем) (рис. 6). Напротив, когда использовался псевдовирус типа BJ01-S, высокие уровни активности люциферазы (более 105 относительных световых единиц) были обнаружены в клеточных лизатах HeLa-huACE2 и HeLa-pcACE2 (фиг. 6A и B), но не в HeLa-RpACE2 (рис. 6C). Интересно, что псевдовирус, упакованный с белком CS, HIV / CS14-608, обнаруживал уровень активности люциферазы, сходный с активностью ВИЧ / BJ01-S (фиг. 6A). Как и ожидалось из вышеупомянутого Вестерн-блоттинга и анализа EM, ВИЧ / CS424-494, в котором RBM BJ01-S был перенесен в основную цепь Rp3-S, не давал активности люциферазы выше фонового уровня ни в одном из трех ACE2-экспрессирующие клеточные линии HeLa...
Обсуждение
Чтобы ответить на эти оставшиеся без ответа вопросы, мы клонировали и экспрессировали ген ACE2 R. pearsonii летучей мыши и исследовали способность белков ACE2 из человека, пальмовой циветы и R. pearsonii поддерживать инфекцию псевдовирусами на основе ВИЧ, содержащими различные конструкции S-белков. Наши результаты показали, что белок летучей мыши SL-CoV (Rp3) S не может использовать ACE2 для входа в клетку независимо от происхождения молекулы ACE2. Мы также продемонстрировали, что человеческий SARS-CoV S не может использовать летучую мышь RpACE2 в качестве функционального рецептора. С другой стороны, мы продемонстрировали, что после замены небольшого сегмента (от 310 до 518) Rp3-S на родственную последовательность BJ01-S, белок CS имитирует функцию BJ01-S в отношении использования рецепторов в системе анализа псевдовируса на ВИЧ...
3. ВИЧ и коронавирус
Лечащие врачи заметили, что среди заболевших коронавирусом не встречаются лица, принимающие калетру – препарат, применяемый для лечения СПИД. Кроме того, с повышением удельного веса людей, инфицированных ВИЧ, заболеваемость ковид-19 и смертность от него, как правило, снижается.
Распространенность ВИЧ и смертность от ковид-19 по странам мира
Распространенность ВИЧ и смертность от ковид-19 по регионам России
4. Ши Чжэньли, 8 февраля 2020 г.:
«Новый коронавирус 2019 года – это природа, наказывающая человеческую расу за сохранение нецивилизованных жизненных привычек. Я, Ши Чжэнли, клянусь своей жизнью, что это не имеет никакого отношения к нашей лаборатории. Я советую тем, кто верит и распространяет слухи из вредных источников в СМИ, а также тем, кто верит в ненадежный так называемый академический анализ индийских ученых, заткнуть свои вонючие рты».
5. Таким образом, синтетическое происхождение коронавируса подтверждается:
- микробиологически,
- клинически,
- эпидемиологически,
- форензически – академическим отчетом–признанием автора осуществленного синтеза и
- даже ее эмоциональной реакцией на состоявшееся разоблачение.